Медицина будущего

В ближайшем будущем диагностировать болезнь можно будет с помощью мобильных приложений. А первые «здоровые» приложения для Android и iOS появляются уже сегодня.

От диагноза по интернету до микросхем в таблетках...

Значение белков теплового шока при вич-инфекции
Материалы / Значение белков теплового шока при вич-инфекции

Актуальность проблемы. В России вопросы стратегии и тактики борьбы с ВИЧ-инфекцией определены работами В.И.Покровского (1988: 1989; 1993). В.И.Покровский (1987) предсказал грядущий размах распространения ВИЧ-инфекции в стране и внед­рил в практическое здравоохранение структуру, предназначенную для борьбы со СПИДом.

В настоящее время ВИЧ-инфекция охватила все страны мира. К середине 1996 года общее количество инфицированных вирусом иммуно­дефицита во всем мире достигло 27,9 миллионов человек (Рахманова А.Г., 1996).

Несмотря на то, что выполнен беспрецедентно большой объем на­учных исследований по. проблеме ВИЧ-инфекции, предложены методы ле­карственной терапии, позволяющие добиваться временного улучшения состояния больных СПИДом. до настоящего времени не известен ни один достоверный случай выздоровления, поэтому СПИД считают бо­лезнью с летальностью 100%.

Проблема ВИЧ-инфекции усугубляется еще и тем фактом, что с начала девяностых годов ВИЧ все более и более завоевывает основную популяцию населения, в то время как в течение первых десяти лет распространение шло преимущественно среди определенных групп насе­ления, так называемых "групп риска" - наркоманы, гомосексуалисты. проститутки, больные гемофилией (Лобзин Ю.В., Казанцев А.П.. 1996).

Актуальность проблемы определяет неуправляемое интенсивное возрастание случаев инфицированности, болезненности и смертности во всех странах мира (Шувалова Е.П., 1995). Выявление ВИЧ-инфицированных лиц не приводит к прекращению передачи ВИЧ от них, нес­мотря на уведомление их об уголовной ответственности за заражение (Покровский В.В. с соавт., 1996). Не решенными остаются основные проблемы СПИДа (Белозеров Е.С. с соавт., 1995):

- отсутствие методов ранней диагностики:

- полная неуправляемость патологических процессов у заболев­шего:

- отсутствие надежных клинических и лабораторных показателей перехода инфекционного процесса из латентной стадии в манифестную.

При СПИДе и ВИЧ-инфекции достаточно хорошо изучены основные лабораторные диагностические показатели, свидетельствующие об инфицированности (Змушко Е.И. с соавт., 1996). Однако вопросы прог­нозирования клинического течения ВИЧ-инфекции требуют дальнейшего изучения. Наибольшее клиническое значение имеет прогноз перехода от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ), а также от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний, кото­рый важен для своевременного назначения этиотропных и патогенети­ческих средств (Рахманова А.Г.. Чайка Н.А., 1989).

При поиске новых тестов, которые давали бы представление о состоянии иммунокомпетентных клеток крови при ВИЧ-инфекции, обра­тила на себя внимание группа сравнительно недавно открытых внут­риклеточных белков, получивших название "белки теплового шока" (БТШ) или "стрессовые белки". Эти белки недостаточно изучены, но уже имеющиеся данные говорят, что они высоко консервативны в про­цессе филогенеза (Lindqulst S., 1986), необычно полифункциональны - играют важную роль во многих внутриклеточных иммунобиохимических процессах как в экстремальных, так и в нормальных условиях (Polla B.S., 1988), что позволяет предположить об участии белков теплового шока в формировании патобиохимических внутриклеточных связей при ВИЧ-инфекции.

В ответ на воздействие неблагоприятных факторов, в том числе и вирусной инфекции, формируется неспецифическая клеточная реак­ция, которая сопровождается усилением процессов свободнорадикального окисления (Иванова В.В. с соавт., 1992: 1996), синтезом бел­ков теплового шока (Kaufman S.H.E.. 1990) и является одним из ме­ханизмов дестабилизации генома клеток-мишеней. В этих условиях не­маловажной представляется роль фермента ксантиноксидазы, которая служит генератором свободных радикалов при ряде патологических состояний клетки и является наиболее значимой среди прооксидантных систем, характерных для лимфоидной клетки (Кожемякин Л.А. с со­авт.. 1992).

Отсутствие в литературе данных по комплексной оценке процес­сов дестабилизации генома, сопряженных с активностью свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы в иммунокомпетентных клетках крови в динамике развития ВИЧ-инфекции не позволяет опре­делить значимость названных показателей для прогноза клинического течения болезни.

Цель исследования: дать оценку возможности ис­пользования показателей белков теплового шока семейства БТШ-70 и комплекса биохимических изменений в мононуклеарах периферической крови в прогнозировании клинического течения ВИЧ-инфекции.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следуюие задачи:

1. Изучить динамику традиционных показателей иммунного стату-а у ВИЧ-инфицированных и определить их прогностическую значимость при переходе клинического течения болезни из одной стадии в дру­гую.

2. Изучить изменения активности ксантиноксидазы, интенсивнос­ти процессов свободнорадикального окисления и показателей неста­бильности генома мононуклеаров периферической крови при ВИЧ-инфек­ции и оценить их прогностическую значимость.

3. Разработать методические подходы к созданию иммунологического метода для количественного и качественного анализа белков семейства БТШ-70.

4. Изучить показатели белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови на разных фазах ВИЧ-инфекции.

5. Определить взаимосвязь изменений белков семейства БТШ-70 и комплекса биохимических показателей дестабилизации генома. свобод­норадикального окисления и системы ксантиноксидазы мононуклеаров периферической крови у больных в динамике заболевания и оценить их значимость для прогноза клинико-манифестных форм ВИЧ-инфекции.

Научная новизна:

1. Впервые установлено, что нарастание накопления конститу­тивной изоформы белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах перифери­ческой крови ВИЧ-инфицированных пропорционально степени выражен­ности клинических проявлений болезни.

2. Показана связь изменения показателей белков семейства БТШ-70 с уровнем нестабильности генома, активностью процессов сво­боднорадикального окисления и системы ксантиноксидазы в мононукле­арах периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией в процессе раз­вития клинической картины заболевания.

3. Установлено, что изменение состояния белков семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови адекватно отражает ве­роятность перехода ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии и от персистирующей генерализованной лимфаденопатии к стадии вторичных заболеваний.

4. Установлено, что ВИЧ-инфекция вызывает нарушение реакции белков теплового шока (БТШ-70) мононуклеаров периферической крови в ответ на повреждающие воздействия (гипертермия. ультрафиолетовое облучение).

Практическая значимость работы.

Комплекс показателей, отражающих состояние системы белков теплового шока, системы ксантиноксидазы, процессов свободнорадикального и нестабильности генома мононуклеаров периферической кро­ви, в совокупности с традиционными иммунологическими показателями может быть использован для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу ПГЛ и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний.

Изучение показателей белков теплового шока мононуклеаров пе­риферической крови человека как защитного механизма неспецифичес­кого действия может может быть применено для оценки эффективности лекарственных средств с иммуномодулирующими свойствами, а также для разработки новых диагностических подходов к прогнозированию иммунодефицитных состояний различной этиологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Переход клинического течения заболевания от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний характеризуется увеличением со­держания конститутивной изоформы семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови.

2. Изменения содержания белков семейства БТШ-70 в процессе ВИЧ-инфекции происходят на фоне увеличения показателей нестабиль­ности генома, интенсификации процессов свободнорадикального окис­ления и повышения активности ксантиноксидазы в мононуклеарах пери­ферической крови.

3. Показатели белков семейства БТШ-70 мононуклеаров перифери­ческой крови в совокупности с традиционными иммунологическими по­казателями возможно использовать для прогнозирования перехода кли­нического течения ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы в фазу пер­систирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к ста­дии вторичных заболеваний.

Результаты исследований до­ложены на XI-й и XII-й научных конференциях молодых ученых акаде­мии (ВМедА, Ленинград, 1990; ВМедА, Санкт-Петербург, 1992), на

VI-м Всесоюзном биохимическом съезде (Санкт-Петербург, 1992), на Первой международной региональной конференции по ВИЧ-инфекции "Со­циальные и медицинские проблемы СПИДа" (Санкт-Петербург, 1994). на заседании Санкт-Петербургского отделения Российского научного об­щества инфекционистов (Санкт-Петербург, 1996), на IV международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург. 1996), на III Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург. 1996). Материалы диссертации использованы в от­четах по теме НИР N 50-93-В12 "Биохимические механизмы формирова­ния иммунодефицитов под влиянием ВИЧ и иммунодиагностика иммуноде­фицитных состояний больных СПИДом" и по теме НИР N 60-95-П4 "Исс­ледование роли системы белков теплового шока в патогенезе ВИЧ-ин­фекции".

Реализация результатов работы.

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Результаты работы используются в практике учебного процесса и научно-исследователь­ской работе кафедры инфекционных болезней, кафедры клинической би­охимии и лабораторной диагностики, в работе НИЛ СПИДа и инфекцион­ных заболеваний в ВС РФ Военно-медицинской академии, кафедры ин­фекционных болезней Семипалатинского государственного медицинского института, кафедры ЛОР-болезней с курсом аллергологии и иммуноло­гии Чимкентского государственного медицинского института, кафедры инфекционных болезней Волгоградского государственного медицинского университета.

Больные были распределены по группам в соответствии с клинической классификацией В.И.Покровского (1989). Вич-инфицированных в стадии инкубации и больных в терминальной стадии не обследовали. Контрольную группу составили 25 практически здоровых мужчин (доно­ров крови) в возрасте от 20 до 39 лет - военнослужащие.

Иммунологические и биохимические исследования проводили в Во­енно-медицинской академии, определение белков теплового шока - на базе института цитологии Академии наук.

Диагноз ВИЧ-инфекции верифицировали серологически - по нали­чию в крови специфических антител к ВИЧ с помощью тест-систем для гетерогенного иммуноферментного анализа методом двойных антител (производства фирм СП"ДиаПЛЮС". Россия-Швейцария, СП"Авиценна", Россия-Сирия). Результаты иммуноферментного анализа подтверждали с помощью иммуноблотинга ("Du Pont", США).

Для оценки иммунного статуса у обследованных пациентов изуча­ли следующие показатели: количество лейкоцитов, лимфоцитов; субпо­пуляции Т-лимфоцитов с помощью проточного цитофлюориметра "EPICS-C" (Coulter elektronics. США-Франция) с применением моноклональных антител фирмы "Ortho Diagnostic Systems"(США): РТМЛ с КонА определяли по методу M.George. J.H.Vaughan (1962); количество В-лимфоцитов, несущих Ig M, G, А, определяли методом иммунофлюоресценции с использованием моноспецифических сывороток к иммуноглобулинам человека; концентрации Ig M. G, А, определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле (Mancini С. et al.. 1963); содер­жание циркулирующих иммунных комплексов по методу Ю.А.Гриневича. А.Н.Алферова (1981).

Для исследования системы белков теплового шока в мононуклеарах периферической крови ВИЧ-инфицированных была получена панель поликлональных антител. При иммунизации животных и аффинной очист­ки антител применяли препарат белков БТШ-70. Для получения препа­рата БТШ-70 использовали белковый экстракт, полученный из мышечной ткани крупного рогатого скота и клеток культуры HeLa. Выделяли препарат методами ионообменной (с DEAE-сефарозой; и аффинной(с АТФ-агарозой) хроматографии. Чистоту полученных белков БТШ-70 про­веряли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Препарат БТШ-70 имел чистоту около 98% и содер­жал смесь конститутивной (hsc-70) и индуцибельной (hsp-70) изоформ семейства БТШ-70.

Из иммунной сыворотки кроликов выделяли антитела к БТШ-70 ме­тодами высаливания и аффинной хроматографии на колонках со смесью белков hsc-70 и hsp-70. Каждая серия антител подвергалась проверке на специфичность двумя методами - иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга. Для определения эпитопов БТШ-70, с которыми реаги­ровали полученные антитела, использовали "сэндвич"-метод иммуно­ферментного анализа и реакция иммунопреципитации с предварительным мечением белков [35S]-метионином. Иммунопреципитаты были подверг­нуты одно- и двумерному электрофорезу (Laemli U.K., 1970; O'Farrel P.H.. 1978). Поликлональные антитела использовали в конструкции иммуноблотинга с последующей денситометрией проявленных зон бел­ков, что позволяло полуколичественно оценивать содержание изоформ семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови больных.

Для проверки функционального состояния системы БТШ-70 мононуклеаров периферической крови служили нагрузочные тесты In vitro - тепловой шок (прогрев клеток при 43±0.3° С в водяном термостате) и ультрафиолетовое облучение с использованием прибора МД-73 "Изольда".

Определение активности ксантиноксидазы и ее формы в мононуклеарной фракции крови проводили по методу У.Прайор (1979). Уровень процессов свободнорадикального окисления тотально в мононуклеарах периферической крови и отдельно в их ядрах оценивали по содержанию продуктов, связывающих тиобарбитуровую кислоту, которые определяли по методу M.Uchlyama, M.Michara (1978). В качестве интегральных биохимических показателей нестабильности генома клеток были избра­ны относительная доля продуктов деградации хроматина - полидезоксинуклеопротеидов, которые являются фрагментами ДНК, (Parks D.A., Granger D.N., 1986) и интенсивность образования однонитевых разры­вов ДНК (Birnboim H.C.. Jewcac J.J.. 1981).

Статистическая обработка цифровых данных осуществляли методом вариационной статистики с использованием параметрического критерия (t) Стьюдента. В случае малых выборок использовали непараметричес­кие статистические критерии. Расчеты производили с использованием программы STATGRAF (Statistical Graphics System), версия 2.1.

2. Результаты собственных исследований Гуморальный и клеточный иммунитет на разных стадиях болезни

Исследование изменений в иммунной системе при развитии ВИЧ-инфекции имело целью выявить показатели, достоверно изменяющи­еся при переходе от одной клинической стадии (фазы) к другой.

Анализ изменений иммунологических параметров больных позволя­ет заключить, что в динамике ВИЧ-инфекции, в первую очередь, про­исходит прогрессирующее снижение функциональной состоятельности иммунной системы по мере развития клинической картины заболевания. Выявленная дефектность иммунного статуса касается, прежде всего. Т-системы иммунитета. Однако далеко не все исследованные традици­онные иммунодиагностические параметры в своей динамике достоверно отражают начало перехода от бессимптомной фазы заболевания к манифестным стадиям. Достоверное различие между группами больных ВИЧ-инфекцией наблюдалось у следующих показателей:

- при переходе от бессимптомной фазы (IIБ) к ПГЛ (IIB) - уве­личение относительного содержания лимфоцитов от 39,00±2,13 до 45,92±1.96% (р<0,05), уменьшение содержания СD8+-лимфоцитов (супрессоров) ОТ 36,90±2.90 до 27,83±1,80% (p<0,01);

- при переходе от ПГЛ (IIB) к стадии вторичных заболеваний (IIIA) - увеличение содержания В (IgA+) -лимфоцитов от 0,06±0,01 до 0,10±0,01xlO9/л (p<0,01), увеличение концентрации IgG от 11,74±0.89 до 13.77±0.66 г/л (р<0.05), увеличение содержания цир­кулирующих иммунных комплексов - уменьшение пропускания светового потока от 92,1±1,2 до 84.3±1.6% (р<0,01).

Как показал анализ, процентные (относительные) показатели во многих случаях нельзя использовать без оценки абсолютных значений. абсолютное содержание В(IgA+)-лимфоцитов, остается неизменным на стадии IIIA по сравнению с бессимптомной фазой, изменение концент­рации иммуноглобулинов IgG происходят в диапазоне нормальных зна­чений (9-15 г/л), что снижает прогностическую информативность ука­занных показателей. Важен и тот факт, что нет единого иммунологического показателя, который бы достоверно характеризовал оба пере­хода ВИЧ-инфекции - от бессимптомной фазы к генерализованной лимфаденопатии и от генерализованной лимфаденопатии к стадии вторич­ных заболеваний.

Содержание продуктов, связывающих тиобарбитуровую кислоту, в мононуклеарах периферической крови

Уже в бессимптомной фазе у ВИЧ-инфицированных отмечается уве­личение средних значений содержания ТБК-связывающих соединений в мононуклеарах периферической крови на 56%, а в их ядрах - на 90%. По мере развития заболевания уровень названных продуктов свободно-радикального окисления возрастает, достигая максимума у больных в стадии IIIB. При этом средние значения в группе больных в стадии IIIB превышали контрольные в 3.2 раза в мононуклеарах и в 4,6 раза в ядрах мононуклеаров. Однако достоверный рост показателей свободнорадикального окисления между группами больных ВИЧ-инфекцией от­мечается в мононуклеарах. но не в ядрах, и только в одном из инте­ресующих нас переходах клинического течения - из бессимптомной фа­зы (ПБ) к ПГЛ (IIB) от 2,82±0,30 до 3,61±0.37 нмоль/106 клеток (р<0,01).

    Смотрите также

    Возможности и ловушки
    Имея успешный опыт проведения эпидемиологического исследования по выборке из нескольких сотен историй болезни, можно было бы надеяться, что автоматизированный доступ к тысячам историй болезни приве ...

    Система RMRS
    Система RMRS (Regenstrief Medical Record System) была разработана Макдональдом и его коллегами в Медицинском центре Университета Индианы (Indiana University Medical Center). Она была введена в эксп ...

    Графические терминалы
    Во многих ситуациях человек может усваивать графическую информацию гораздо быстрее, чем ее текстовые или числовые эквиваленты. Графические представления сведений из истории болезни можно подраздели ...





    Витаминоподобные вещества

    Easy to start Еще около 10 соединений имеют витаминоподобные свойства и играют ключевые роли в обменных клеточных процессах организма.

    Читать дальше...

    Рациональное питание

    Россия имеет низкую культуру знаний в отношении питания. Они основаны на традиционных подходах без учета новаторства.

    Читать дальше...

    Минеральные вещества и их значение

    Native RTL Support Минеральные вещества относятся к незаменимым факторам питания и должны в определенных количествах постоянно посту­пать в организм.

    Читать дальше...