Виды хроматогорафии

Целью нашей работы является оптимизация условий очистки вакцины против вируса клещевого энцефалита .Рассмотрим основные виды хроматографии, которые могут применяться для этих целей

Важнейшим вариантом жидкостной хроматографии является ионнообменная хроматография Этот метод позволяет проводить разделение не только в аналитических целях, но и разделять вещества в более крупных масштабах, например при промышленном разделении веществ. Особенностью метода является то, что сорбент(ионнообменник) способен ионизироваться, отдавая подвижные ионы (H, Na) в подвижную фазу,при этом сам ионнообменник приобретает заряд.

В случае отрицательного заряда матрицы говорят об катионо-обменнике, в случае положительного об анионообменнике. Катионо- и анионо-обменники бывают сильными и слабыми. Сильные ионизированы во всем интервале pH , а слабые лишь в определенном интервале, зависящим от свойств конкретного ионобменника,точнее от природы ионогенных групп ионнообенника. Ионизацией слабых ионообменников можно управлять, меняя pH среды, что имеет большое значение в процессе разделения. Ионообменники представляют собой полимеры, модифицированные введением ионогенных групп. В случае катионообменников это –SO3 -,-COO--,-CH2-SO3--,с соответствующими противоинами. К анионообмееным группам относят тетраалкиламмониевые группы с положительным зарядом. Особенностью ионообменной хроматографии является то ,что она позволяет отделять и разделять заряженные частицы. Разделение основано на электростатическом взаимодействии ионов подвижной фазы с неподвижными ионогенными группами ионообменника.К органическим веществам, способных образовывать ионы в растворе относят соединения четырех валентного азота, трех валентного кислорода, аминокислоты, белки, карбоновые кислоты. Из обилия перечисленных веществ видно как важен метод. Как уже было отмечено в основе разделения веществ лежит электростатическое взаимодействие ионов подвижной фазы и ионов матрицы. Однако это взаимодействие обратимо, на самом деле устанавливается равновесие между ионогенной группой, соединенной с органическим ионом и ионогенной группой, соединенной с неорганическим противоионом (H+ ,Cl-, OH-, Na+).Очевидно ,что чем больше неорганических ионов ,тем слабее будут связаны разделяемые вещества. Поэтому растворы неорганических солей можно использовать в качестве элюентов. Важной характеристикой ионнообменника явяется его кривая титрования , она позволяет сделать вывод о силе ионообменника. Для разеления ,например аминокислот также необходимо знать их кривые титрования, т.е. в какой области pH аминокислота находиться в форме аниона, а в какой в форме аниона. Сопоставляя кривые титрования аминокислот и ионообменника можно сделать вывод о возможности разделения данных аминокислот на данном ионообменнике при определенном значении pH.

Однако не только электростатическое взаимодействие влияет на разделение веществ, немаловажны и стерические факторы--такие как величина пор ионообменника, расстояние между соседними ионогенными группами. Особое значение это имеет при разделенни макромолекул, например белков, в данном случае электростатическое взаимодействие может лимитироваться стерическими факторами и диффузией макромолекул к ионогенным группам. Немаловажно в связи с этим отметить влияние структуры белка (первичная вторичная и т.д.) очевидно, что скорость диффузии будет для них неодинакова, -молекула в виде глобулы будет легче передвигаться, чем разветвленная молекула. Особенностью макромолекул является и то , что они могут нести несколько одноименных зарядов, в этом случае возможно взаимодействие одной молекудлы с несколькими ионогенными группами(как правило двумя),интересно отметить, что прочность связи при этом увеличивается более, чем вдвое. Это объясняется тем, что одна связь как бы страхует другую. -при разрыве одной связи молекула колеблется около положения равновесия, ясно , что в этом случае ей легче возобновить вторую связь. Однако возможность такой двое связанности скорее негативно влияет на процесс разделения, так как крепко закрепившиеся молекулы очень трудно отделить от ионообменника приходиться применять концентрированные растворы солей, что может нарушить структуру белка , что ведет к его денатурации, также резко снижается разделительная способность колонки. Также следует отметить , что при подобной сорбции белковая молекула может деформироваться под структуру матрицы , что также может вести к денатурации. Таким образом применительно к очистке белковых веществ можно сказать, что метод позволит отделить некоторые незаряженные молекулы от белковых молекул, которые как правило заряжены, а также можно провести разделение и от посторонних белков, только нужно знать кривые титрования белков и кривую титрования ионообменника.

Важным видом хроматографии является гель-фильтрация. Она позволяет разделять молекулы в зависимости от их молекулярных масс. Разделение в этом методе основано на различной скорости диффузии молекул с разной молекулярной массой (различными размерами). Сорбентом в данном методе служит гель , точнее мелкие частицы, внутри пронизанные нитями (фибриллами).Диффузия внутрь этих частиц лимитируется размерами ,а точнее подвижностью молекул которая зависит от их молекулярной массы. Чем меньше молекулы, тем легче они способны проникать вовнутрь гранул геля, соответственно более тяжелые частицы практически не проникают в гранулы, так как менее подвижны. Частицы попавшие внутрь гранул под действием диффузии движутся внутри и с равной вероятностью могут выйти наружу, но пространство внутри гранул геля пронизано нитями и молекулы претерпевают многочисленные столкновения с сетью фибрилл и способны надолго задерживаться внутри гранул. Таким образом мы видим ,что более легкие молекулы способны надолго задерживаться внутри гранул, и их скорость продвижения будет меньше скорости движения более тяжелых молекул.

Описанный метод очень эффективен для разделения белков и других высоко-молекулярных соединений. Варьируя характеристики частиц геля ,- такие как размер пор на поверхности гранул, характеристики внутреннего строения гранул ,- можно добиться разделения определенных веществ, т.е. того, что вещества с определенной молекулярной массой будут проходить ,остальные продвигаться с меньшей скоростью, особенно это важно при разделении белков на фракции по их молекулярным массам, а также при фракционировании полимеров по их молекулярным массам , для анализа качества образца, нахождения его молекулярно-массового распределения. Применительно к нашей теме следует сказать, что гель-фильтрация как нельзя лучше подходит для отделения белковой части вакцины от низкомолекулярных веществ, обессаливания препарата, и в некоторых случаев к концентрированию.

Одним из интереснейших методов жидкостной хроматографии является аффинная хроматография. Она позволяет разделять отдельные ферменты ,белки и даже вирусы и простейшие биологические объекты .Особенностью данного вида хроматографии является то , что разделение основано на разного вида специфических взаимодействиях частиц подвижной фазы с сорбентом. Сорбентом в данном виде хроматографии служит гель типа агарозы к которому ковалентно привязаны подходящие лиганды ,им может быть субстрат какого-либо фермента ,Когда через такой сорбент пропускают подвижную фазу , то из нее будет сорбироваться только соответствующий фермент, он будет прочно связан с сорбентом, но его оттуда можно смыть избытком растворителя, или можно использовать закрепленный фермент, для непрерывного превращения молекул субстрата из подвижной фазы При модификации сорбента соответствующими антителами можно удерживать заданные вирусы ,при модификации антигеном удерживать ген. Очевидно , что метод аффинной хроматографии очень высокоэффективен из-за селективности специфических взаимодействий и очень перспективен ,так как позволяет концентрировать биологические объекты , которые важны при производстве вакцин и сывороток.