Препаративная жидкостная хроматография

Целью нашей курсовой работы является оптимизация условий очистки вакцины против вируса клещевого энцефалита от низкомолекулярных сопутствующих веществ. Очистка производится методом гель-фильтрации. Производство вакцины подразумевает большие объёмы веществ, много большие, чем те, с которыми приходится работать в лаборатории. Это накладывает на процесс определённые особенности, и обуславливает отделение препаративной хроматографии от аналитической. Одной из важных особенностей препаративной жидкостной хроматографии является работа со значительно большими количествами вещества - до 0.1г. на 1г. насадки, и количество очищенного материала в единицу времени может достигать 100г и выше. Надо также сказать, что выделение (очистка) веществ методом жидкостной хроматографии на сегоднейший день является сравнительно дорогой операцией. Поэтому при разработке методики важно учитывать такие факторы, как эффективность разделения, время проведения разделения (включая время подготовки процесса). Часто, стараясь сэкономить на одном (уменьшить время разделения , увеличивая количество образца), можно сильно проиграть на другом - качестве разделения, тогда конечный выделенный продукт может содержать слишком большой процент примесей, что сведёт на нет все труды и затраты по разделению. Исходя из этих соображений ясно, насколько важно найти ту "золотую середину" в условиях, чтобы сохранять эффективность очистки и проводить разделение наиболее дёшево.

При препаративном разделении часто приходится сталкиваться с такими понятиями, как перегрузка колонки. Перегрузка -это такая нагрузка, которая больше не позволяет выделять продукт с требуемой чистотой или степенью извлечения.

Эксперимент всё ещё является лучшим путём определения оптимальной нагрузки. Вообще величина нагрузки в большинстве случаев от параметров, которые влияют на число теоретических тарелок. Также методом проб и ошибок было установлено, что для фиксированного размера образца более сложные разделения требуют значительно большего отношения массы насадки к массе образца. Структура и свойства молекул, характер их взаимодействия с подвижной и неподвижной фазами в присутсвии других компонентов образца, геометрия колонки, структура и свойства сорбента ,наряду с другими аспектами,- являются критическими для определения оптимального размера образца, при котором достигается максимальная эффективность и практичность разделения в препаративной хроматографии.

В [3] приводятся данные, рекомендуемой нагрузки (масса сорбента на 1 грамм образца) в зависимости от a:

Селективность (aij)	Сложность Разделения	Ж.Х.-метод	Масса адсорбента на 1 г. образца
>2.0	Лёгкое	Открытые колонки	~15		~20
>1.5	Среднее	Возможно на открытых колонках	50-500		До~500
>1.3	Сложное	На грани возможности Т.С.Х.		До 500		500-5000
<1.3	Очень сложное	Только В.Э.Ж..Х.		-----		-------

(для силикагелевых сорбентов)

В препаративной жидкостной хроматографии размер теоретической тарелки

зависит от количества и концентрации образца, введённого в слой.

Понятно, что чем ближе сродство 2-х разделяемых веществ к каждой из фаз,

тем труднее их разделить , нужно больше актов сорбции-десорбции. Достигнуть требуемого разделения в таком случае можно уменьшив размер образца, либо увеличить число теоретических тарелок (собственную эффективность колонки). Есть несколько способов увеличения эффективности колонки :

a.)уменьшить размер частиц в колонке тех же размеров

b.)увеличить эффективную длину колонки одним из следующих путей :

1. заполнить более длинную колонку,

2. соединить несколько колонок последовательно,

3. использовать циркуляцию;

При увеличении длины колонки увеличивается время разделения и затраты растворителей, но с другой стороны можно брать большие объёмы образцов. Максимальная нагрузка сильно зависит от a , при малом a нельзя взять большую нагрузку , так как пики сильно сольются, при большом a можно значительно увеличить нагрузку , так в [3] приводятся данные о том, что при увеличении a от 1.05 до 1.2 нагрузка может быть увеличена в 15 раз, либо при той же нагрузке можно уменьшить длину колонки, сократив затраты на насадку , растворитель и сэкономив время, что выгоднее нужно решать в

каждом конкретном случае

Нагрузка и эффективность.

При увеличении нагрузки падает эффективность (число теоретических тарелок), - вначале медленно , а затем с линейной скоростью. Однако в ряде случаев скорость потери эффективности всё-же может быть меньше скорости скорости увеличения нагрузки , таким образом если коэфициент разделения достаточно высок , можно смело увеличивать нагрузку (до определённого уровня). Также следует отметить , что измеряемая эффективность для той же массы образца выше в случае более концентрированных растворов [3]. Интересно отметить, что колонки, заполненные частицами большего диаметра изначально менее эффективны , но при увеличении нагрузки она остаётся почти постояноой [3].Таким образом при ведении трудных разделений простых смесей лучше использовать более длинные колонки с крупными частицами сорбента.

Нагрузка и время удерживания.

В оптимальном случае время разделения дожно быть минимальным, однако с ростом нагрузки эффектвность разделения можно поддерживать на должном уровне только снизив скорость проведения анализа ( увеличив время ) , либо провести разделение в несколько приёмов, что также приведёт к увеличению времени.Однако в большинсве случаев условия можно оптимизировать таким образом, что селективность станет значительно высокой (>1.3), тогда можно уменьшить время разделения, проводить процесс с большей скоростью, а если a>2 то с предельно возможной. Вообще возможности современной препаративной хроматографии позволяют проводить разделение в том же масштабе времени, что и аналитическое разделение.