Иммуноферментный анализ

Определенное значение для реализации максимальной чувствительности ТФИФА имеет правильный выбор субстрата. Наряду с естественным желанием использовать субстраты с высокой удельной хромофорной активностью (высокий коэффициент молярной экстинкции окрашенного конечного продукта) необходимо принимать во внимание такие важные факторы, как растворимость субстрата и продуктов его ферментативной модификации в условиях проведения анализа и стабильность этих субстратов при хранении и в процессе эксперимента.

Чувствительность диагностических систем на основе ТФИФА лишь частично зависит от типа выбранной при конструировании диагностикума фермент-субстратной пары. В основном эта чувствительность определяется другими факторами, которые трудно учесть: способом синтеза конъюгата, гомогенностью и удельной активностью используемых для такого синтеза антител и антигенов, а также многочисленными параметрами проведения анализа (способом иммобилизации выявляемого антигена или антител, степенью их солюбилизации в биологическом или клиническом образце и т. д.). Именно в связи с этим в литературе приводится такой широкий диапазон пределов чувствительности для уже разработанных методик ТФИФА. На основании анализа этих данных трудно рекомендовать при конструировании вновь создаваемых твердофазных иммуноферментных систем наилучший фермент и наилучший субстрат. Следует лишь отметить, что с помощью использованных ранее фермент-субстратных пар метод ТФИФА позволяет выявить в исследуемом образце нанограммовые количества антигена при использовании хромофорных субстратов и пикограммовые количества антигена при применении флюорохромных субстратов.

Если при конструировании новой системы на основе ТФИФА невозможно или нежелательно использование коммерческих универсальных конъюгатов (антивидовых фермент-меченных антител), то встает вопрос о синтезе конъюгата на основе выбранных фермента и антител. Как уже указывалось, наиболее специфичные и высокоактивные конъюгаты могут быть получены на основе только максимально очищенных белковых ингредиентов. Однако в связи с относительной сложностью и трудоемкостью работ по тщательной очистке бактериальных и вирусных антигенов в настоящее время при разработке иммуноферментных систем часто используются либо цельные сыворотки, либо суммарные фракции иммуноглобулинов, содержащие в своем составе как специфические, так и балластные антитела. Антигены также часто не подвергаются надлежащей очистке, и используемый при конструировании диагностикума белок составляет лишь небольшой процент от суммарного белка. В связи с этим резко повышается вероятность неспецифических реакций, особенно опасных при высокой чувствительности, которой обладают ИФ-методики.

Большое значение для успешного использования ТФИФА в микробиологических и вирусологических исследованиях имеет правильная интерпретация полученных результатов. Это особенно важно при использовании клинического материала, когда понятия «контроль» и «опыт» часто определяются с большой долей субъективизма. Для тестирования положительных проб вначале ставят 6-8 тестов на образцах, взятых от заведомо здоровых людей, и определяют среднюю оптическую плотность контроля и стандартное отклонение при естественном разбросе данных за счет различных методических погрешностей. Проба обычно считается положительной, если отклонение ее оптической плотности от контроля в 3 раза превышает стандартное.