Генное зондирование

Первые сообщения о коммерческих образцах наборов для генного зондирования появились в 1986 г. - ими стали наборы для определения М. pneumoniae , L . pneumoniae . Затем появились наборы для идентификации других патогенов, в том числе - вируса иммунодефицита человека.

В настоящее время ведутся интенсивные разработки по упрощению процедуры генного зондирования до одной - двух стадий процесса. Предприняты попытки отказаться от сорбции материала на мембране.

Наиболее перспективным является получение нерадиоактивных (так называемых - холодных) зондов. На этой же основе развивается методика гибридизации, позволяющая устанавливать наличие патогена в препаратах срезов, пунктатов ткани, что особенно важно при патоморфологическом анализе (гибридизация in situ ).

Существенным этапом в развитии методов генного зондирования явилось использование полимеразной реакции амплификации (Р CR ). Этот подход позволяет увеличить концентрацию определенной (заранее известной) последовательности ДНК в пробе за счет синтеза многочисленных копий in vitro . Для проведения реакции к исследуемому образцу ДНК добавляют препарат фермента ДНК-полимеразы, избыток дезоксинуклеотидов для синтеза и, так называемые, праймеры - два типа олигонуклеотидов величиной 20-25 оснований, соответствующих концевым участкам интересующей последовательности ДНК. Один из праймеров должен быть копией начала участка считывания кодирующей цепи ДНК при направлении считывания 5-3, а второй - копией противоположного конца некодирующей цепи. Тогда при каждом цикле полимеразной реакции происходит удвоение количества ДНК-копий.

Для осуществления связывания праймеров необходима денатурация ДНК (плавление) при 94°С с последующим доведением смеси до 40-55°С. В первом сообщении, описывающем метод, полимеразу добавляли вновь после каждого взаимодействия праймеров с ДНК, так как фермент не выдерживал нагревания до 94 0 . В настоящее время чаще используют ДНК- полимеразу термофильной бактерии Т. aquaticus , выдерживающую такую температуру и имеющую максимум активности при 70°С.

Для проведения реакции сконструированы программируемые инкубаторы микропроб, позволяющие легко чередовать изменения температуры, оптимальной для каждого этапа реакции.

Реакция амплификации позволяет существенно повысить чувствительность анализа при генном зондировании, что особенно важно при низкой концентрации инфекционного агента. Особое значение этот подход приобрел при диагностике СПИДа и некоторых других вирусных инфекций. Причем в этих случаях впервые была показана возможность амплификации и для РНК-содержащих вирусов (непосредственно, или через провирусную ДНК).

Одним из существенных достоинств генного зондирования с амплификацией является возможность исследования субмикроскопического количества патологического материала. Так уже показана возможность генетического анализа материала единственной волосяной сумки, взятой из человеческой кожи, или нескольких десятков буккальных клеток, полученных простым полосканием полости рта.

Другой особенностью метода, более важной для анализа инфекционного материала, является возможность выявления скрытых (молчащих) генов. Например, выявление гена холерного токсина в штаммах без его фенотипического проявления, позволяет сделать важные выводы при эпидемиологическом анализе.

Методы, связанные с использованием генного зондирования, безусловно, будут более широко внедряться в практику диагностики инфекционных заболеваний по мере их упрощения и удешевления.