Иммуноферментный анализ

Построение диагностикумов для серодиагностики бактериальных и вирусных заболеваний, выявление и идентификация с их помощью антител в биологических и клинических образцах проводится аналогичным образом. Обычно приготовляется так называемый иммуносорбент - антиген, иммобилизованный на твердом носителе (либо за счет его прямой сорбции на твердую матрицу, либо за счет ковалентной «пришивки» к этой матрице, либо за счет иммуносорбции на иммобилизованные первичные антитела). Затем исследуемая сыворотка, содержащая или не содержащая выявляемые антитела, контактирует с иммуносорбентом. Степень адсорбции специфических к иммобилизованному антигену иммуноглобулинов обычно определяется с помощью антивидовых конъюгатов. Использование антивидовых антител к различным классам иммуноглобулинов позволяет выявить в исследуемом образце не только специфические к использованному антигену антитела, но и провести их изотиповой анализ.

Конкретные методики диагностики и серодиагностики заболеваний бактериальной и вирусной природы, использующие иммуноферментные подходы, отличаются многими параметрами, в частности, типом и формой адсорбента, на котором иммобилизуется иммунный комплекс. В качестве твердофазного носителя может использоваться целый ряд полимеров: полиметилметакрилат, нейлон, тефлон, полипропилен и др. Однако наиболее часто в качестве адсорбента в настоящее время применяется полистирол и поливинилхлорид. Для удобства проведения анализа эти адсорбенты производятся в виде многолуночных плашек, шариков или палочек. Использование плашек, изготовленных из оптически прозрачного полистирола или поливинилхлорида, позволяет проводить все операции ТФИФА, включая конечное фотометрирование хромофорной субстратной смеси. Не менее существенным преимуществом полистироловых плашек перед другими формами адсорбента является возможность автоматизации практически всех операций анализа, включая трудоемкие этапы промывки лунок и внесения в них однотипных реагентов.

Следует отметить, что использование полистироловых плашек для целей ТФИФА имеет и некоторые недостатки - высокие требования к чистоте полимерного материала и точности изготовления плашек и нерентабельность их использования для одиночных анализов.

Большое внимание при постановке ТФИФА обычно уделяется правильному выбору фермент-субстратной системы. В современных диагностических иммуноферментных тест-системах используется большое число разнообразных ферментов и субстратов. Выбор той или иной фермент-субстратной пары для использования в конкретной тест-системе на основе ТФИФА диктуется несколькими соображениями. Во-первых, обращается внимание на стабильность в процессе анализа и хранения как крайне чувствительного к структурным внутримолекулярным перестройкам конъюгата, так и во многих случаях светочувствительного хромофорного или флуорохромного субстрата. Во-вторых, это отсутствие используемого в диагностикуме фермента или субстрата (свободного или связанного) в биологических или клинических образцах, которые предстоит анализировать. В-третьих, наличие соответствующей регистрирующей аппаратуры (спектрофотометра или спектрофлуориметра). И, наконец, в-четвертых, выбор той или иной фермент-субстратной пары диктуется естественным желанием экспериментатора или клинициста иметь в руках систему, обладающую максимальной специфичностью и чувствительностью.